Wisata kuliner part 1

disela-sela agenda sibuk kita sebagai relawan, tetep aja kita sempatkan untuk wisata kuliner. jadi cukup sarapan pagi aja yang makan di posko. untuk makan siang dan dinnernya kita putuskan untuk wisata kuliner. yah walaupun kalo malam tetep aja masak atau aku harus nyari lauk untuk mereka, soalnya sudah terlalu capek untuk melanglang buana mencari sesuap nasi.

untuk makan siang yang menjelang senja ini, kita putuskan untuk wisata kuliner dengan makan bakso. kita dapet reverensi tempat bakso ini dari tia (ibu ketua). yah walaupun agak jauh sih tempatnya dari posko, yaitu di daerah jalan parangtritis (jamal bahasa gaulnya) dan masih masuk-masuk gang juga. tapi itu tidak mengecewakan kita, rasanya not bad. bahkan enak banget. porsinya yang sangat luar biasa, cocok lah buat anak kos yang butuh makan banyak banget. 

biasa otak-otak anak kos itu cari makannan yang banyak, enak, dan murah. dan disitulah tempatnya. ini dia secarik kenangan yang masih tersimpan rapi untuk dinikmati setelah kita tua nanti. halah...

si megi alias tante, dia kalo makan anteng kok gak macem-macem. entar klo udah abis baru mulai bersuara.

kak asis yang paling ngalah, mau di kasih apapun tetep iya deh. moga aja tetep punya prinsip idup ya kak...

si nala yang tiap makan anti saos dan kecap namun bersahabat baik dengan cabe dan sambel.

aku yang kebalikan sama nala, doyan banget sama kecap. tp kalo saos gak terlalu suka.

si ivan yang porsi makannya paling banyak karena dapat tambahan mie dari nala dan nita. itu mangkoknya sampai gak muat.

si tia yang tetep cool dan elegan walaupun lagi makan.

si jimmy yang badannya paling kecil di antara cwo-cwo di kelompok kita tapi makannya gak kalah sama ivan. soalnya dia peliara naga di perutnya.

si nita yang tetep kalem kalo lagi makan, bentar lagi pasti bilang "aku gak abis,van bantuin donk".

si ulum, yang doyan banget klo makan saos. bahkan sering banget di marahin ivan gegara kebanyakan makan saos , gak sehat gitu. liat aja makannanya pink.

pokonya reverensi bakso ini tidak mengecewakan deh. silahkan di coba terutama buat anak kos yang ada di jogja.

KKN Al Azwa

ini dia kenangan yang sulit untuk di lupakan ketika kita sudah mulai memasukin kehidupan selanjutnya. yak bener KKN ketika masih di bangku S1. kita namakan gank kkkn relawan gunung merapi kita dengan KKN Al Azwa. entah itu artinya apa, pokoknya artinya bagus kata si ulum.

kita semua adalah mahasiswa semester 5 dari perguruan tinggi negeri yang berbasis islam. sebenarnya sih belum waktunya mengambil mata kuliah KKN, namun mendadak musibah gunung merapi yang memuntahkan laharnya sangat dahsyat di bulan november 2010 lalu. di daerah yogyakarta yang tadinya damai sentoda mendadak kacau dan berhamburan pungungsi di mana-mana. maka dari itu di adakanlah KKN relawan gunung merapi.

tadinya sih kita cuma iseng-iseng jadi relawan di daerah maguoharjo, itu lho yang mendadak sering nongol di TV-TV gedung sepak bola yang jadi tempat pengungsian dadakan gunung merapi. nah berhubung di situ relawannya membludak. jadi kita di maguoharjo cuma di suruh iris-iris kentang dan berbagai macam maka dari itu kita memutuskan untuk hengkang dari tempat itu.

setelah bertahan di maguoharjo 2 hari, kita memutuskan untuk mencari daerah lain dan dapatlah kita di daerah bantul tepatnya di imogiri timut. di sana terdapat 400 lebih pengungsi dan belum ada relawan yang membantu. jadilah kita pahlawan yang sok-soan baik untuk mereka, hahaha. tapi kita bener-bener baik kok. sungguh...

nah inilah dia agenda KKN relawan kita, di mulal dari tanggal 10 november dan berahir 10 desember 2010. tapi gak jadi sebulan doank, dari universitas meminta penambahan hari sekitar 2 mingguan. jadilah kita terdampar di imogiri sekitar hampir 2 bulanan. gak papa sih sebenernya, toh kita seneng juga.

aku perkenalkan dulu anggota al azwa. ini aku pulih foto yang paling natural, mulai ada yang tidur, bangun tidur dan semacamnya. jangan marah sama aku ya klo entar jelek-jelek. oke ini dia

ibu ketua kita yang namanya tia, dia paling sibuk di antara kita. soalnya walaupun dia lagi kkn tapi masih bisa ngelesin anak-anak SD dan kegiatan organisasi yang biasa dia ikuti tetep jalan. keren kan...

 yang ini ivan, paling rakus dan doyan makan dia antara kita. dia tukang sering cari masalah dan susah banget klo bilangin. tapi klo gak ada dia gak ada dia sepi, gak ada yg ngajakin berantem.

yang ini ulum sebagai sekertaris dan masih pacaran sama nita pada waktu itu lho. klo sekarang udah putus. 

cowok satu ini kak asis, dia tempat salah dan hilaf pokoknya. kalo ada tang salah dari kita, tetep aja kak asis yang di salahin. hahaha. orangnya sabar bingit. besok yang jadi istrinya pasti seneng.

yang ini namanya maigy atau tante, karena dia suka banget sama cwo yang sudah berumur alias om-om. dia tukang tidur dan sering banget berantem sama anak-anak seperti berantem sama nala cuma gegara rebutan kamar mandi yang ujung-ujungnya diem-dieman sehari penuh. belum juga berantem sama tia, nita, ulum dan ivan. tapi orangnya baik kok, baik bingit malah.

yang ini namanya nala. yah dia termasuk orang yang sabar no 2 dari kita-kita jadi kita manfaatkan. klo gak ada kak asik, dia lah yang jadi sasaran kita. hahaha maaf ya nal...

yang ini sudah pasti aku atau biasa di panggil gustin. aku di sini menjabat sebagai bendahara yang baik dan seksi konsumsi buat sarapan anak-anak tiap pagi. maaf ya, aq gak bisa masak jadi trima aku cariin lauk aja, trus masak nasi deh. masalah beres... 

ini dia si jimmy, cwo paling di idolain abg-abg labil, ibu-ibu muda bahkan anak-anak kecil juga ada, luar biasa kan dia. yah begitulah dia, paling pintar bersosialisasi dengan semua kalangan walaupun kadang kita geleng-geleng kalo dia keceplosan pakek bahasa jawa ngoko (bahasa jawa kasar) yang ngapak bingit.  

yang ini si nita atau biasa di panggil bibik, pacarnya si ulum. dia orangnya pendiam, manutan dan gak banyak ngerempongin kita. bisa di bilang dia paling aman untuk kita mintain tolong. maaf ya ta...

mungkin cukup itu aja untuk mengenal karakter dari kita. sebenernya sih masih banyak yang perlu di tulis untuk menggambarkan sifat masing-masing orang di al azwa dari borok-boroknya, kebiasaannya dan sifat baiknya tapi bisa-bisa encok ni tangan. udah dulu ya, koneksi internetnya lagi jelek nih... :D

New year 2012

berawal dari 4 anak manusia yang berteman dan kelaparan di malam tahun baru, tapi gangsi ngajakin anak kos masing-masing buat makan malam takut di kira jomblo (tapi emang bener jomblo kok), eh maaf ya,aq tetep ada yang ngajakin keluar kok. itu lho si tanto gebetan lama tapi males aq gubris (biar keliatan laku :D). akhirnya qta memutuskan untuk makan malam bareng di mcd. yah dari pada gak ada yang ngajakin keluar, mending keluar bareng temen di malam yang sayang klo di lewatkan di kamar kos saja.

qta berangkat sekitar jam 21.00 wib dengan gerimis romantis yang mengiringi qta. sayang qta cuma temenan jadi gak jadi romantis. sesampainya qta di mcd, ternyata ngantri bingit. dengan menyingkirkan berbagai macam orang dan kalangan elit, dapatlah qta tempat duduk dan 4 porsi makan dengan porsi lengkap. tanpa babibu langsunglah qta makan, secara lapar bingit. mau makan aja harus ngantri panjang kayak ngantri BLT aja. 

setelah hampir tengah malah qta memutuskan untuk keluar dari mcd liat kembang api. and you no what?? jl jend sudirman itu macet, penuh banget dengan orang dan motor. oh iyayah namanya juga taun baru. dengan menggunakan tenaga yang habis makan banyak mukailah si ivan menyelundup di tengah keramainnya dengan di ikuti  aq, devi dan ulum yang ngejagain qta di belakang. 

finally sampailah qta di kali code tepat waktu. dan bunyi kembang api pun terdengar di mana-mana. terlihat indah dan warna-warni. dengan rasa syukur yang teramat sangat karena umurku bisa sampai juga di tahun 2012. trimakasih tuhan...

kata kak ari tulang " ketika layar babak itu turun menutup. apa yang qta sudah lakukan bersama, namanya sudah berubah menjadi kenangan". slamat tinggal tahun 2011, slamat tinggal kenangan buruk, slamat tinggal tahun di mana ayah q meninggal dan tahun yang mulai mendewasaakana q dengan keadaan dunia yang sebenarnya, slamat tinggal pahlawan hidup q. 2012, PLEASE BE NICE...

Blood alms

jogja sabtu pagi yang entah tanggal berapa. radar anak kos yang mencium bau-bau gratongan dan banyak hadiahnya karena ngebaca twit di jogja update ada donor darah di mm atau malioboro mol. langsunglah qta ber 4 aq, mb kiam, eway dan mb kiki meluncur ke sana. perjalanan dari kos ke mm yang hanya butuh waktu 15 menit jadi tidak butuh waktu lama untuk untuk memuaskan rasa penasaran qta.

setelah mengisi data, cek tensi darah, golongan darah dan HB, akhirnya yang bisa lolos cuma aq, mb kiam dan mb kiki yang dari semalem dia lah yang sudah sangat bersemangat untuk menyumbangkan darahnya, eh ralat biar dapet kaos dan ****** (dilarang sebut merek). secara yang mengadakan donor darah ****** jadi yang bisa lolos donor berhak mendapatkan itu. bahkan malemnya dia makan gule, sarapannya pakek ati ampela dan nyemilnya air galon sama coklat silverqueen yang dark. gak tau sih itu sebenernya ngaruh apa gak buat naikin HB dan tensi, toh buktinya dia lolos.

inilah muka-muka lagi ngantri giliran donor

setelah menunggu sekitar 2 jam lebih, tiba lah giliran kita buat donor. diawali dengan mb kiki yang masuk duluan, kemudian aq dan mb kiam. ini fotonya

berhubung mb kiam gak berani donor darah alias takut ngeliat darah, jadilah dia jadi tukang foto buat qta yang donor. hahaha. maafkan baim ya allah...

seteblood almslah semuanya donor dan ngambi hadiahnya masing-masing, dan aq yang keluar paling belakang gegara mbak yang ngambil darah q lama. dari kejauhan terlihatlah mb kiam dan mb kiki yang sedang duduk tak berdaya dengan muka pucet dan bibir putihnya (sayang gak punya fotonya). tinggal lah aq sama eway yang masih baek-baek mencari pertolongan ke PMI. eh malah sama bapaknya bilang "pingsan beneran atau boongan mb?" rasanya pingin aq tonjok pakek tangannya mb kiki yang udah sabuk hitam taekwondo. gemes...

untungnya ada temen q anak informatika (gak usah sebutin namanya ya,entar dia besar kepala) yang menolong q dengan ngasih teh anget segelas doank. yah lumayan lah dari pada gak sama sekali. selidik demi selidik ternyata mb kiam mau pingsan gara-gara ngeliat darah q, secara dia takut darah dan mb kiki gara-gara baru 3 hari dia selesai haid. ampun dah #gubrak.  

oke setelah baikan qta memutuskan untuk pulang dan ternyata tanganku bekas donor tadi bengkak gedhe meennn... di suruh mb kiam lapor ke petugas dan sama bapak petugasnya di olesin salep yang menurutku gak ngaruh sama sekali.

setelah 2 minggu lebih aq kompres dengan air hangat, barulah tangan q baikan dan dari kejadian itu aq gak mau donor darah lagi. karena jika bengkak lagi itu sangat mengganggu aktivitas q. sungguh...

sidang kehidupan

sidang kehidupan?? wow terdengar menyeramkan memang,tp tergantung perseorangnya menganggapnya seperti apa. namun bagi aq sidang ini membuat q tidak bisa tidur, makan tak enak, belajar pun tak mau, bawaannya pingin nangis di depan dosen kalo gak bisa jawab nantinya. pasti sudah mulai bisa di tebak kan?? yah benar sidang SKRIPSI.

sidang kripsi q tidak berjalan dengan baik,mungkin salah q karena kurang belajar denga tekun tp mungkin juga salah membimbing q. ah entah lah aq juga bingung.sampai saat ini pun belum mengerti mana yang salah dan yang benar.anggap saja qta semua salah.

yah aq perkenalkan dosen pembimbing q yang bernama Dr.Hj S********. M.Si. maaf aq samarkan, takut terjadi sesuatu yag diinginkan (misalnya: dia mendadak terkenal gara2 postingan blok q) oke fokus lagi. sebenernya sih bu doktor (panggilan dari q buatnya) baik tp kenapa baiknya cuma sama anak bimbingan yang cwo aja. aq kan cemburu...tp bukan itu yang membuat q sakit hati sampai saat ini.

hal yang membuat q sakit hati, kenapa skripsi q di bilang hancur banget,lha trus selama ini yang ngoreksi skripsi q siapa?? kenapa di bilang seperti itu di saat sidang berlangsung. kenapa tidak waktu bimbingan?? kenapa tidak waktu aq mengambil judul itu?? kenapa dan kenapa yang selalu ada di pikiran q.

entah lah. sampai sekarang belum ada jawaban yang bisa menenangkan q.

yah klo boleh bilang si ibu doktor ini klo ngoreksi skripsi gak pernah di baca. cuma di liat penulisan font nya dan warna nya saja. ajib kan...gak usah rempong-rempong revisi banyak tp entar mati di sidang.hahaha. dan gak enaknya itu doank.

muka sesudah dan sebelum sidang, tetep cerah ceria :D

udah ah males bahas bu doktor terus, entar aq dosa. sekarang serahin aja sama allah biar dia yang jawab dan yang bales semuanya. yang salah aq atau bu doktor. #okesip

nah ini dia sahabat-sahabat q yang setia menunggu q dari awal sidang sampai akhir dan beliin snack buat penguji, pembimbing dan gak lupa buat mereka sendiri. buat mereka sendiri?? yah, jelas mereka butuh nyemil. gila aja nungguin aq 2 jam di ruang sidang klo gak aq kasih snack bisa di sumpahin miskin 7 turunan gak ngasih makan ke cacing-cacing yang ada di perut mereka. 

aq kenalin yah dari kanan yang berbaju coklat itu nala, dia yang jemput aq lho...baik kan dia. yang pakek baju ijo atau kuning itu aq juga kurang tau, dia adalah cummy dan yang pakek baju merah si tante megi. mereka berdua itu seksi konsumsi untuk aq. mereka harus bangun pagi dan keliling jogja buat nyari makanan. besar banget kan pengorbanan mereka. jadi terharu aq...

setelah 2 jam berlalu, aq di nyatakan lulus oleh penguji dan jadilah aq, Agustina Barida Wijayanti S.Si. (sarjana sains dalam bidang kimia). alhamdulillah... :')

menghapus jejakmu

terdengar absurt banget kan?? atau bahkan terdengar seperti judul lagunya peterpan yang bintang video klipnya mb cantik alias dian sastro. bukan itu sih yang aq madsud. tanggal 1 juli 2013 kemarin, aq baru bisa move on dari manusia yang hampir 2 tahun lebih ini nyangkut di hati q yang gak mau pergi. panggil saja mas dekstop background lepi. kenapa bisa di sebut itu nanti aq ceritakan.

kertas peninggalannya

pasti pikirannya kenapa cuma kertas, ada sih yang lainnya cuma gak tau udah ke mana, hehehe. tp aq yakin kok masih nyempil di kamar kos, maklum kamar kos q cuma 3x2,75 meter luasnya. bayangin aja aq harus berbagi tempat dengan kasur, 2 lemari, meja, tv, dispender, printer dan masih banyak barang tetek mbengek yang anak kos butuhkan. nah seperti inilah kamar kos q 

 belum di beresin  

back to the topic. kata lau lebih mudah mencintai dari pada melupan yang butuh waktu seumur hidup. nah maka dari itu aq baru bisa move on 2 tahun. lebih baik kan dari pada seumur hidup. 

oh iya kenapa aq panggil dengan mas desktop background lepi karena udah lama banget itu mukannya nampang di lepi dan gak aq ganti. sampai temen-temen q bilang " kenapa gak di ganti?" atau "kenapa harus dia yang jadi backgrond?". yah jawaban q pasti "bentar lah, belum saatnya aq ganti, tp entar aq janji klo aq udah siap pasti aq ganti kok".

dan akhirnya setelah ngeliat foto di WA nya dan statusnya yang bikin aq gemeteran (sumpah itu beneran) akhirnya aq tobat juga. dan inilah dekstop background q yang baru. tara.... 

sepertinya allah harus menamparku dulu baru aq bisa sadar. yah walaupun terlambat tapi aq sadar juga kok. mulai kemarin aq putuskan untuk menutup kenangan dan membuka lembaran baru. bahagia itu sederhana gak perlu keramaian, gak perlu kata-kata dan gak perlu kemewahan.

ELISA PCR

1.      ELISA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.  ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. ELISA dalam pengertian sederhana adalah sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang  tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang  spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi  secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalamplate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan  kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi  antibodi  dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA  juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

Beberapa Tipe ELISA

A.     Indirect ELISA

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah:

1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar  yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.  Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.

8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

B.     Sandwich ELISA

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

1.      Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’

2.      Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

3.      Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

4.      Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

5.      Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan  antigen

6.      Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer

7.      Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang

8.      Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia

9.      Diukur absorbansinya  untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

C.      ELISA kompetitif

Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu:

1.      Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya

2.      Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen

3.      Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi

4.      Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim

5.      Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:

2.      PCR

A. Prinsip Kerja

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106 kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik). Sebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki pengetahuan, urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga oligonucleotides tertentu dapat diperoleh. Hal ini tidak perlu tahu apa-apa tentang urutan intervening antara primer. Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabil-panas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium.

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif. Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase.

PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah, sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali, dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup, 2 pangkat 30 alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu, kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.

PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.

B. Kegunaan

Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:

1. amplifikasi urutan nukleotida.
2. menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.
3. bidang kedokteran forensik.
4. melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”.

C. Tahapan PCR

Terdapat tiga tahap utama di dalam setiap siklusnya, yaitu :

1) Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 ^oC – 95 ^oC selama 30-60 detik.

2) Penempelan primer

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 ^oC – 60 ^oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya.

3) Reaksi polimerisasi (extension)

Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72^oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan dengan dNTP yang komplemen pada sisi 3’nya. Jadi, seandainya ada 1 copy gene sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial.

D. Komponen PCR lainnya:

1) Enzim DNA Polymerase

Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini ternyata tidak aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Selain itu, enzim ini hanya bisa dipakai untuk perpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi kurang spesifik. Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dalam perkembangannya kemudian dipakai enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi. Oleh karenanya, penambahan enzim tidak perlu dilakukan di setiap siklusnya, dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin.

2) Primer

Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal dan akhir DNA target. Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA synthesizer.

3) Reagen lainnya

Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut menentukan keberhasilan reaksi PCR. Komponen tersebut adalah dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl₂. Konsentrasi ion Mg²⁺dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangat kritis. Konsentrasi ion Mg²⁺ ini sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi.

Konsentrasi ion Mg²⁺ dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangat kritis. Konsentrasi ion Mg²⁺ ini sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi. Oleh sebab itu, penambahan berbagai pereaksi harus selalu diperhatikan, jangan sampai ada ion-ion lain maupun chelating agent yang dapat mengganggu kosnentrasi ion Mg²⁺ dalam larutan. Secara umum, sebaiknya konsentrasi ion Mg²⁺ bebas yang terdapat dalam larutan adalah sekitar 2 mM .

E. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr)

RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction. Seperti namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in vitro menggunakan template RNA.

Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR, templat yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang mempunyai poly(A) tail pada ujung 3′, maka oligo dT, random heksamer, maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan untuk memulai sintesa cDNA.

Reverse transcriptase biasanya digunakan untuk mensintesis rantai pertama cDNA dari RNA. Reverse transkriptase dapat dipurifikasi dari beberapa sumber, seperti: avian myeloblastosis virus (AMV) dan Molones murine leucemia virus (MMLV). AMV reverse transkriptase adalah RNA-dependent DNA plimerase yang menggunakan RNA rantai tunggal sebagai templat dan dapat mensintesis cDNA dengan arah 5’→3’ jika terdapat primer. Sama seperti aktivitas DNA polimerase.

H. Metoda Deteksi Produk PCR

Produk PCR adalah segmen DNA (amplikon) yang berada dalam jumlah jutaan copy, tetapi tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Oleh karena itu PCR perlu diikuti dengan suatu tahap akhir yang bertujuan untuk memvisualisasikan produk PCR serta sekaligus bertujuan untuk mengetahui ukuran produk PCR dan mengetahui apakah produk yang dihasilkan adalah benar seperti yang diinginkan. Salah satu metoda deteksi yang umum dilakukan adalah elektroforesis gen agarosa.